Génétique

Ptites questions :
- Ca marche comment le criblage d'une banque ordonnée par PCR
- La stratégie 3 de la dia I.29 il l'a vue? J'ai pas de notes... C'est juste un mélange des 2 autres?

Merci bien et bon courage a tous (petite pensée particulière pour les pharmacos ...)

c'est quoi la strategie 3 du dia I.29? de quoi ça parle? Moi j'ai toutes les dias trés mélangées.

Pour la dia I-29, pr la stratégie 3, j ai juste noté 2 ribosomes par transcrits, ce qui donne 4 protéines.
Mais je ne comprend pas en quoi la production est plus constante avec la stratégie 1 plutôt qu'avec les 2 autres....

C'est justement pcq la production de transcrits est constante que la stratégie est différente des autres... La stratégie 2 c'est l'explication du fait que la transcription est stochastique -> la production de transcrits est assez faible (et pas constante) mais la traduction de ces quelques transcrits peut être importante. Dans la stratégie 1, la transcription est plus constante donc la quantité de transcrits est plus importants. Cependant, a la fin, on obtient le même nombre de protéines que par la stratégie 2 pcq la traduction est plus faible.

Quelqu'un pourrait m'expliquer la neasted PCR? Je vois pas quelle est la différence avec la PCR utilisant l'oligo dT pour faire la reverse transcription puis un couple d'amorce interne pour faire l'amplification par PCR.

Dans la Q-PCR avec sondes d'hydrolyse, on fait une courbe de calibration -> graphe du nombre de cycles en fonction du nombre de copies. Ce nombre de copies c'est le nombre engagé au départ ou obtenu après amplification? Pcq dans le graphe juste au dessus le nombre de copies est celui engagé au départ...

Mmmhh cor bcp d'autres questions, mais je me limiterai la..
Merci !

pour la neasted pcr :
l'oligo dT va capturer tous les ARNm et tu sélectionne à l'étape suivante, c àd avec l'autre amorce et donc tu dois repérer le bon parmi tt un tas d ARN tandis qu'avec le neasted comme tes 2 amorces sont internes tu n'as plus k'1 ARN ke tu repères facilement avec la deuxième amorce. Ok la PCR est réputée hyprasuprasensible et donc on pourrait croire k'elle est assez grande pr se débrouileer tte seule et repérer le bon arn parmi tte une chiée de mauvais mais apparement c pas le cas... petite paresseuse va!

par contre bibi pige pas l'enchainement des trucs pour la RPA, qq1 pourrait me répéter ca en termes simples?

nested PCR - PCR "nichée"
Pour la RPA - la RNase va cliver tout ce qui est simple brin, alorss s' il y a eppisage alternatif, on aura les deux types de fragments: 2 fragments de petite taille et 1 de grande taille.

Bonjour à tous!!!
Pour Candice et la Real time PCR, je pense qu'il parle tjs du nbre de copies engagées au départ.
Pour Yohan, on utilise la RPA ds plusieurs applications dc j sais pas laquelle tu comprend pas (celle qu'a expliqué Alionka ou celle pour identifier le point de départ de la transcription???)
J ai également 2 petites questions:
-Ds la technique SAGE, je comprend pas pourquoi forme-t-on des ditags??? Pourquoi on utilise comme tag 2 fois la même séquence (ditag) plutôt que simplement 1 tag (1 séquence). J sais pas si vs comprenez ma question??
-Dans la mesure de l'activité CAT, que veut dire TLC??? (pIII-21)
Bonne merde à tous dans votre étude,
Audrey

TLC - chromato sur couche mince, en anglais.
Dans SAGE ce n'est pas le meme tag dans le ditag. Chaque tag represente une sequence specifique d'un messager. On les met ensemble car plus facile a sequencer, etc.

Qqun a des "echos" des années précedentes, comment se passe cet examen?

Pourriez vous m'eclairer, svp sur les pièges qu'on peut avoir dans les co-transfections (transitoires). Les controles - j'ai compris, mais les pièges.... Il dis qque chose par rapport à ça que je n'arrive pas à comprendre. Merci.

Moi le seul piège que j'ai c'est :
La construction promoteur constitutif-facteur de transcription peut inhiber un inhibiteur du promoteur a tester... On pense donc qu'il y a activation par fixation du facteur de transcription sur le promoteur mais en fait il y a activation par inhibition d'un inhibiteur (ceci va aussi provoquer une activation dans le cas ou on cotransfecte avec la construction promoteur muté pour son site de liaison du facteur de transcription-gène rapporteur -> intérêt de faire les contrôles).

Ptites questions :
- il faut étudier les exemples? Si oui (et en fait dans tous les cas pcq j'aimerais bien comprendre) :
- l'exemple "transcription in vitro au départ du promoteur du gène de la Tg dans un extrait nucléaire de tissu thyroïdien de chien" : j'ai pas compris la manip... ca veut dire quoi AdML?
- dans l'exemple "expression du récepteur nucléaire orphelin NGFI-B dans des cellules thyroïdiennes en culture primaire", c'est quoi NGFI-BdeltaTD

Merci bien!

PS : c'est bien au B1-OO5?

Pour le truc de NGFI-B il n'entre pas dans les details, c'etait juste pour montrer qu'on doit faire la courbe avant la manip, pour determiner la "m.o.i." sur laquelle on peu jouer pour ajuster le niveau d'expression.
AdML = antigens Major Late de l'adenovirus. C'est un promoter de reference pour quantifier l'activité du promoteur de la Tg.

Merci Alionka pour tes réponses.
Il me reste 2 questions:
-la première, c'est la même que candice, qu'est ce que NGFI-BdeltaTD??
-dans la production de prot recombinante en bactérie, j ai un trou ds mes notes: comment ça marche quand on met les 2 vecteurs ensemble??? (vecteur avec Plac et gène polT7+vecteur avec PT7 et ADNc).

J-2

Quand tu met du lactose, il y a alors production de la pol T7 et celle-ci permet alors la transcription de ton ADNc

Pte question: pour le EMSA, on travaille sur tout le génome???

Pour la EMSA moi j'ai mis qu'on travaillait avec des sondes marquées...

-dans la partie des siRNA on parle des gènes de levure line 4,line14 et line 28. j'ai pas d'autres notes... Ca sert a quoi, c'est quoi,...???
-dans la trasgenèse de remplacement conditionnelle, on veut placer des sites Lox autour du 2è exon pour ensuite pouvoir l'éliminer. Mais au cours de la manip, quand on doit sélectionner le bon recombinant parmi les 3 possibilités, on élimine celui où on élimine tt entre le 1er et le 3è site Lox (donc on élimine aussi le 2è axon). Pourquoi on ne garde pas celui-la, ca nous ferait des étapes de manip en moins?
-quelle est la différence entre la GST pulldown et l'approche protéomique dans l'étude des interactions entre protéines?

Pour Candice, j ai noté que chez la levure, on a observé une augmentation de l'expression du gène Lin-4 et une diminution des gènes lin-14 et lin-28. En effet, lin-4 est processé en petits si-RNA et vient inhiber l expression des gènes lin-14 et lin-28.

Pour la transgénèse de remplacement, si on élimine pas tout de suite le 2ème exon c'est pour maintenir le foetus viable. On veut éliminer l'exon 2 plus tard dans le développement afin que la souris soit viable. C'est l'avantae de la transgenèse de remplacement conditionnelle par rapport à la transgénèse de remplacement simple ou souvent les embryons ne sont pas viables car le gène délété est trop important.

Pour la production de protéine recombinante, ce que je ne comprends pas c'est pourquoi la polymérase T7 entraîne la transcription de l'ADNc sous le promoteur de la polymérase T7. En quoi active-t-elle ce promoteur??

Ah oui, j ai encore oublié une question!!
Vs avez parlé de Neasted PCR mais je ne vois pas où ça se trouve dans le cours...
Qqn peut m'aider??

Pour la polymérase T7, c'est cette polymérase que se fixe sur le promoteur et transcrit les gènes en aval... Une autre polymérase ne peut faire la transcription car non spécifique.

La neasted PCR c'est dans la partie RT-PCR... Au début on expose les différents choix d'amorces possibles...

Merci pour les réponses!

L'approche protéomique diffère de la GST par le fait qu'on peut utiliser un tag, n'importe lequel, du moment qu'on a une colonne d'affinité pour lui, deuxièmement, c'est surtout la combinaison avec la spectro de masse qui fait la difference.

salut,

quelqu un peut il m'expliquer les résultats obtenus dans les réactions de compétition avec TTF1

Merci bcp

Bonne grosse merde à tous pour demain

salut qq'un peut il m'expliquer les résultat de l'expérience de compétition avec TTF1

merci bcp et bonne grosse merde à tous pour demain

désolé

a chaque fois j'ai des problème avec mon ordi
au départ le message passe pas donc je le refait et conclusion mainenant il est écris 2 fois

Je ne vois pas de quelle experience tu parles. On a une experience de competition avec le ttf1?

ben sur le graphe on observe, pour différents promoteurs, le rapport d'expression en présence de HD (inhibe liaison TTF-1) et en présence de HDmuté (n'exprime pas TTF-1).

Pour le promoteur SV40 le rapport est proche de 1 car TTF-1 ne se lie pas à ce promoteur et donc l'inhibition de liaison de TTF-1 (en présence de HD) n'a aucune influence sur l'activité de ce promoteur.
Pour les autres promoteurs, le rapport est inférieur à 1 car HD diminue la liaison de TTF-1 à ces promoteurs, ce qui diminue leur activité.
Je ne sais pas si je suis claire mais bon... j aurai essayé!!!

A demain,
Audrey

comment on peut voir sur la PCR si il y a epissage alternatif ou multigenie? svp?